TIANSeq mRNA קאַפּטורע קיט

דערווייַל, הויך-טרופּוט סיקוואַנסינג טעכנאָלאָגיע איז דער הויפּט באזירט אויף דער ווייַטער דור סיקוואַנסינג טעכנאָלאָגיע. זינט די לייענען לענג פון די ווייַטער דור סיקוואַנסינג טעכנאָלאָגיע איז לימיטעד, מיר מוזן ברעכן די סיקוואַנס אין פול לענג אין קליין פראַגמענט לייברעריז צו סיקוואַנס. לויט די באדערפענישן פון פאַרשידענע סיקוואַנסינג יקספּעראַמאַנץ, מיר יוזשאַוואַלי קלייַבן איין-ענדס סיקוואַנסינג אָדער טאָפּל-ענדיקן סיקוואַנסינג. דערווייַל די דנאַ פראַגמאַנץ פון דער ווייַטער דור סיקוואַנסינג ביבליאָטעק זענען בכלל פונאנדערגעטיילט אין די קייט פון 200-800 בפּ.

אַ) דנאַ איז נעבעך קוואַליטעט און כּולל ינכיבאַטערז. ניצן הויך-קוואַליטעט דנאַ סאַמפּאַלז צו ויסמיידן ינאַבישאַן פון ענזיים טעטיקייט.

ב) די סומע פון ​​דנאַ מוסטער איז ניט גענוגיק ווען ניצן PCR- פריי אופֿן צו בויען דנאַ ביבליאָטעק. ווען די אַרייַנשרייַב פון די פראַגמאַנטיד דנאַ יקסידז 50 נג, פּקר-פריי וואָרקפלאָוו קענען זיין סעלעקטיוולי דורכגעקאָכט בעשאַס די ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן פּראָצעס. אויב די קאָפּיע נומער פון דער ביבליאָטעק איז צו נידעריק צו זיין גלייך סיקוואַנס, די דנאַ ביבליאָטעק קענען זיין אַמפּלאַפייד דורך PCR נאָך די אַדאַפּטער ליגאַטיאָן.

c) רנאַ קאַנטאַמאַניישאַן פירט צו ומפּינקטלעך ערשט דנאַ קוואַנטיפיקאַטיאָן רנאַ קאַנטאַמאַניישאַן קען עקסיסטירן אין די רייניקונג פּראָצעס פון גענאָמיק דנאַ, וואָס קען פירן צו ומפּינקטלעך דנאַ קוואַנטיפיקאַטיאָן און ניט גענוגיק דנאַ לאָודינג בעשאַס ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן. רנאַ קענען ווערן אַוועקגענומען דורך טרעאַטינג מיט רנאַסע.

א -1

אַ) קליינע פראַגמאַנץ (60 בפּ -120 בפּ) דערשייַנען קליינע פראַגמאַנץ זענען יוזשאַוואַלי אַדאַפּטער פראַגמאַנץ אָדער דימערס געשאפן דורך אַדאַפּטערז. רייניקונג מיט Agencourt AMPure XP מאַגנעטיק קרעלן קענען יפעקטיוולי באַזייַטיקן די אַדאַפּטער פראַגמאַנץ און ענשור די סיקוואַנסינג קוואַליטעט.

ב) גרויס פראַגמאַנץ דערשייַנען אין דער ביבליאָטעק נאָך פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן די דנאַ פראַגמענט פון די ביבליאָטעק וועט פאַרגרעסערן מיט 120 בפּ נאָך די ליגאַטעד די אַדאַפּטער. אויב די דנאַ פראַגמענט ינקריסאַז מיט מער ווי 120 בפּ נאָך די אַדאַפּטער ליגיישאַן, עס קען זיין געפֿירט דורך אַבנאָרמאַל פראַגמענט אַמפּלאַפאַקיישאַן פון יבעריק פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן. רידוסינג די נומער פון PCR סייקאַלז קענען פאַרמיידן די סיטואַציע.

c) אַבנאָרמאַל גרייס פון ביבליאָטעק דנאַ פראַגמאַנץ נאָך אַדאַפּטער ליגאַטיאָן די לענג פון די אַדאַפּטער אין דעם קיט איז 60 בפּ. ווען די צוויי ענדס פון די פראַגמענט זענען ליגייטיד צו די אַדאַפּטערז, די לענג וועט בלויז פאַרגרעסערן מיט 120 בפּ. אויב איר נוצן אַ אנדערע אַדאַפּטער ווי די קיט, ביטע קאָנטאַקט דער סאַפּלייער צו צושטעלן באַטייַטיק אינפֿאָרמאַציע, אַזאַ ווי די לענג פון די אַדאַפּטער. ענשור אַז די עקספּערימענט וואָרקפלאָוו און אָפּעראַציע נאָכגיין די סטעפּס דיסקרייבד אין די מאַנואַל.

ד) אַבנאָרמאַל גרייס פון די דנאַ פראַגמענט איידער די אַדאַפּטער ליגאַטיאָן די סיבה פֿאַר דעם פּראָבלעם קען זיין געפֿירט דורך פאַלש אָפּרוף טנאָים בעשאַס דנאַ פראַגמאַנטיישאַן. פאַרשידענע אָפּרוף צייט זאָל זיין געוויינט פֿאַר פאַרשידענע דנאַ אַרייַנשרייַב. אויב די דנאַ אַרייַנשרייַב איז מער ווי 10 נג, מיר רעקאָמענדירן צו סעלעקטירן דעם אָפּרוף צייט פון 12 מין ווי די סטאַרטינג צייט פֿאַר אַפּטאַמאַזיישאַן, און די פראַגמענט גרייס וואָס איז געשאפן אין דעם צייט איז דער הויפּט צווישן 300-500 בפּ. ניצערס קענען פאַרגרעסערן אָדער פאַרמינערן די לענג פון דנאַ פראַגמאַנץ פֿאַר 2-4 מינוט לויט זייער אייגענע רעקווירעמענץ צו אַפּטאַמייז די דנאַ פראַגמאַנץ מיט די פארלאנגט גרייס.

א -2

אַ) פראַגמענטאַטיאָן צייט איז נישט אָפּטימיזעד אויב די פראַגמאַנטיד דנאַ איז צו קליין אָדער צו גרויס, ביטע אָפּשיקן צו די גיידליינז פֿאַר סעלעקציע פון ​​פראַגמענטאַטיאָן צייט אין די לימעד צו באַשליסן די אָפּרוף צייט, און נוצן דעם צייט פונט ווי אַ קאָנטראָל. אָפּרוף סיסטעם צו פאַרלענגערן אָדער פאַרקירצן 3 מין צו מאַכן מער פּינטלעך אַדזשאַסטמאַנט פון פראַגמאַנטיישאַן צייט.

א -3

אַבנאָרמאַל גרייס פאַרשפּרייטונג פון דנאַ נאָך פראַגמאַנטיישאַן באַהאַנדלונג

אַ) אומרעכט טאָינג אופֿן פון פראַגמאַנטיישאַן רייידזשאַנט, אָדער די רייידזשאַנט איז נישט גאָר געמישט נאָך טאָינג. טאָ די 5 × פראַגמענטאַטיאָן ענזיים מיקס רייידזשאַנט אויף ייַז. אַמאָל טאָד, מישן די רייידזשאַנט יוואַנלי דורך דזשענטלי פליקקינג די דנאָ פון די רער. דו זאלסט נישט וואָרטעקס די רייידזשאַנט!

b) די דנאַ אַרייַנשרייַב מוסטער כּולל עדטאַ אָדער אנדערע פּאַלוטאַנץ דעלעטאַטיאָן פון זאַלץ ייאַנז און טשעלאַטינג אגענטן אין די דנאַ רייניקונג שריט איז דער הויפּט וויכטיק פֿאַר די הצלחה פון דער עקספּערימענט. אויב דנאַ איז צעלאָזן אין 1 × טע, נוצן דעם אופֿן צוגעשטעלט אין די לימעד צו דורכפירן פראַגמאַנטיישאַן. אויב די EDTA קאַנסאַנטריישאַן אין די לייזונג איז ומזיכער, עס איז רעקאַמענדיד צו רייניקן די דנאַ און צעלאָזן עס אין דעיאָניזעד וואַסער פֿאַר סאַבסאַקוואַנט אָפּרוף.

c) ומפּינקטלעך ערשט דנאַ קוואַנטיפיקאַטיאָן די גרייס פון פראַגמאַנטיד דנאַ איז ענג שייך צו די סומע פון ​​דנאַ אַרייַנשרייַב. פאר פראַגמאַנטיישאַן באַהאַנדלונג, פּינטלעך קוואַנטיפיקאַטיאָן פון דנאַ מיט קוביט, פּיקאָגרעען און אנדערע מעטהאָדס איז יקערדיק צו באַשליסן די פּינטלעך סומע פון ​​דנאַ אין דעם אָפּרוף סיסטעם.

 ד) דער צוגרייטונג פון דער אָפּרוף סיסטעם טוט נישט נאָכגיין די ינסטראַקשאַנז. כּדי צו דערגרייכן די בעסטער ווירקונג, אַלע אָפּרוף קאַמפּאָונאַנץ זאָל זיין שטעלן אויף אייז און דער צוגרייטונג פון דער אָפּרוף סיסטעם זאָל זיין דורכגעקאָכט נאָך גאַנץ קאָאָלינג. נאָך דער צוגרייטונג איז געענדיקט, מישן ונ דורך מיט אַ פליק אָדער פּיפּעט. צי ניט וואָרטעקס!

1. ימפּראַפּער מיקסינג אופֿן (וואָרטעקס, היציק אַסאַליישאַן, אאז"ו ו) וועט פאַרשאַפן אַבנאָרמאַל פאַרשפּרייטונג פון ביבליאָטעק פראַגמאַנץ (ווי געוויזן אין די פאלגענדע פיגור), אַזוי אַפעקטינג די קוואַליטעט פון דער ביבליאָטעק. דעריבער, ווען פּריפּערינג די אָפּרוף לייזונג פראַגמענטאַטיאָן מיקס, דזשענטלי פּיפּעטטע אַרויף און אַראָפּ צו מישן, אָדער נוצן די פינגגערטיפּ צו פליק און מישן יוואַנלי. זיין אָפּגעהיט ניט צו מישן מיט וואָרטעקס.

2. הויך ריינקייַט דנאַ מוזן ווערן גענוצט פֿאַר ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן

■ גוט דנאַ אָרנטלעכקייַט: די עלעקטראָפאָרעסיס באַנד איז מער ווי 30 קב אָן טיילינג

■ אָד 260/230:> 1.5

■ אָד 260/280: 1.7-1.9

3. דנאַ אַרייַנשרייַב סומע מוזן זיין פּינטלעך עס איז סאַגדזשעסטיד צו נוצן קוווביט און פּיקאָגרעען מעטהאָדס צו קוואַנטיפיי דנאַ, אלא ווי נאַנאָדראָפּ.

4. דער אינהאַלט פון EDTA אין דנאַ לייזונג מוזן זיין באשלאסן EDTA האט אַ גרויס השפּעה אויף די פראַגמאַנטיישאַן אָפּרוף. אויב דער אינהאַלט פון EDTA איז הויך, דנאַ רייניקונג דאַרף זיין דורכגעקאָכט איידער די סאַבסאַקוואַנט פּראָבע.

5. די פראַגמענטאַטיאָן אָפּרוף לייזונג מוזן זיין צוגעגרייט אויף אייז די פראַגמאַנטיישאַן פּראָצעס איז שפּירעוודיק צו אָפּרוף טעמפּעראַטור און צייט (ספּעציעל נאָך אַדינג ענכאַנסער). אין סדר צו ענשור די אַקיעראַסי פון אָפּרוף צייט, ביטע צוגרייטן די אָפּרוף סיסטעם אויף אייז.

6. די אָפּרוף צייט פון די פראַגמאַנטיישאַן מוזן זיין פּינטלעך די אָפּרוף צייט פון די פראַגמאַנטיישאַן שריט וועט גלייַך ווירקן די גרייס פון די פראַגמענט פּראָדוקטן, אַזוי די גרייס פאַרשפּרייטונג פון דנאַ פראַגמאַנץ אין דער ביבליאָטעק.

1. וואָס טיפּ פון מוסטער איז אָנווענדלעך צו דעם קיט?

די אָנווענדלעך מוסטער טיפּ פון דעם קיט קענען זיין גאַנץ רנאַ אָדער פּיוראַפייד מרנאַ מיט גוט רנאַ אָרנטלעכקייַט. אויב גאַנץ רנאַ איז גענוצט צו בויען די ביבליאָטעק, עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן די ררנאַ דיפּלישאַן קיט (קאַט#4992363/4992364/4992391) צו באַזייַטיקן ררנאַ ערשטער.

2. קענען FFPE סאַמפּאַלז ווערן גענוצט צו בויען אַ ביבליאָטעק מיט דעם קיט?

די mRNA אין FFPE סאַמפּאַלז וועט זיין דיגריידאַד אין אַ זיכער מאָס, מיט קאָרעוו נעבעך אָרנטלעכקייַט. ווען ניצן דעם קיט פֿאַר די ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן, עס איז רעקאַמענדיד צו אַפּטאַמייז די פראַגמאַנטיישאַן צייט (פאַרקירצן די פראַגמאַנטיישאַן צייט אָדער נישט דורכפירן פראַגמאַנטיישאַן).

3. וואָס קען פאַרשאַפן אַ קליין דיווייישאַן פון די ינסערטאַד אָפּשניט דורך די גרייס סעלעקציע שריט אין די פּראָדוקט מאַנואַל?

גרייס סעלעקציע וועט זיין געפירט אויס אין שטרענג לויט די גרייס סעלעקציע שריט אין דעם פּראָדוקט מאַנואַל. אויב עס איז דיווייישאַן, די סיבה קען זיין אַז די מאַגנעטיק קרעלן זענען נישט באַלאַנסט צו צימער טעמפּעראַטור אָדער נישט גאָר געמישט, די פּיפּעט איז נישט פּינטלעך אָדער די פליסיק בלייבט אין די שפּיץ. עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן די עצות מיט נידעריק אַדסאָרפּטיאָן פֿאַר דער עקספּערימענט.

4. סעלעקציע פון ​​אַדאַפּטערז אין ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן

די ביבליאָטעק קאַנסטראַקשאַן ינווענטאַר כּולל קיין אַדאַפּטער רייידזשאַנט, און עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן דעם ינווענטאַר צוזאַמען מיט TIANSeq איין-אינדעקס אַדאַפּטער (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. קק פון דער ביבליאָטעק

קוואַנטיטאַטיווע דיטעקשאַן ביבליאָטעק: Qubit און qPCR זענען געניצט צו באַשליסן די מאַסע קאַנסאַנטריישאַן און מאָלאַר קאַנסאַנטריישאַן פון די ביבליאָטעק ריספּעקטיוולי. די אָפּעראַציע איז שטרענג אין לויט מיט די פּראָדוקט מאַנואַל. די קאַנסאַנטריישאַן פון די ביבליאָטעק וועט בכלל טרעפן די רעקווירעמענץ פון NGS סיקוואַנסינג. דיטעקשאַן פון די פאַרשפּרייטונג קייט פון ביבליאָטעק: ניצן Agilent 2100 Bioanalyzer צו דיטעקט די פאַרשפּרייטונג קייט פון די ביבליאָטעק.

6. סעלעקציע פון ​​אַמפּלאַפאַקיישאַן ציקל נומער

לויט די ינסטראַקשאַנז, די נומער פון פּקר סייקאַלז איז 6-12, און די נומער פון פּקר סייקאַלז איר דאַרפֿן זאָל זיין סעלעקטעד לויט די מוסטער אַרייַנשרייַב. אין לייברעריז מיט הויך טראָגן, אָפט אַמפּלאַפאַקיישאַן יוזשאַוואַלי אַקערז אין וועריינג דיגריז, וואָס איז ארויסגעוויזן דורך אַ ביסל גרעסערע שפּיץ נאָך די שפּיץ פון די ציל קייט אין די דיטעקשאַן פון Agilent 2100 Bioanalyzer, אָדער די דיטעקטאַד קאַנסאַנטריישאַן פון קוביט איז נידעריקער ווי QPCR. מילד אַמפּלאַפאַקיישאַן איז אַ נאָרמאַל דערשיינונג, וואָס קען נישט ווירקן די סיקוואַנסינג פון ביבליאָטעק און סאַבסאַקוואַנט דאַטן אַנאַליסיס.

7. ספּייקס דערשייַנען אין די דיטעקשאַן פּראָפיל פון Agilent 2100 ביאָאַנאַליזער

דער אויסזען פון ספּייקס אין די דיטעקשאַן פון Agilent 2100 ביאָאַנאַליזער איז ווייַל פון די אַניוואַן פראַגמאַנטיישאַן פון סאַמפּאַלז, ווו עס וועט זיין מער פראַגמאַנץ אין זיכער גרייס, און דאָס וועט ווערן מער קלאָר ווי דער טאָג נאָך פּקר ענריטשמענט. אין דעם פאַל, עס איז סאַגדזשעסטיד נישט צו דורכפירן די גרייס סעלעקציע, ד"ה שטעלן די פראַגמאַנטיישאַן צושטאַנד צו 94 ° C פֿאַר 15 מינוט ינקובאַטעד, ווו די פראַגמענט פאַרשפּרייטונג איז קליין און קאַנסאַנטרייטאַד און די כאָומאַדזשיניטי קענען זיין ימפּרוווד.